SOUTHERN BLOT ANALYSIS

SOUTHERN BLOT ANALYSIS
Oleh :
Sinta Sasika Novel, S.Si
Tahun 2009

Southern blot adalah suatu teknik yang dikembangkan oleh Edwin. M. Southern pada 1975, seorang ahli biologi asal Inggris. Teknik ini digunakan untuk pendeteksian suatu DNA sequence spesifik (gen atau lain) dalam sample kompleks DNA (selular DNA). Ini juga digunakan untuk menentukan bobot molekular suatu restriksi fragmen dan untuk mengukur sejumlah relatif dalam sample berbeda. Di bawah kondisi-kondisi optimal, Southern blot mendeteksi ~ 0.1 pg DNA yang menarik. Blot teknik digunakan untuk memindahkan protein DNA dan RNA ke suatu pengangkut sehingga dapat dipisahkan, dan sering juga diikuti penggunaan suatu gel ectrophoresis. Southern blot digunakan untuk memindahkan DNA. Digunakan biologi molekular untuk melihat kemungkinan kehadiran suatu urutan DNA dalam suatu sample DNA. Southern blot Selatan berkombinasi gel agarose electrophoresis untuk separasi ukuran DNA dengan metoda untuk memindahkan DNA ke suatu membran filter untuk pemeriksaan hybridisasi. Metoda lain adalah Western blot dan Northern blot memiliki prinsip kerja yang sama tetapi menggunakan RNA dan protein.

Setelah electrophoresis, gel tersebut diperlakukan dengan suatu alkali yang menyebabkan DNA terdenaturasi dan terpisah menjadi rantai tunggal. Suatu membran seperti selaput ditempatkan pada gel dan diberi tekanan melalui pengisapan atau metoda mundane dalam kertas handuk (paper towels) dengan suatu berat. DNA berpindah tempat ke membran dan stick. Membran DNA-impregnanted dibakar atau menyebar secara permanen dengan menyertakan DNA tersebut. Molekul yang kemudian diperlakukan dengan suatu pemeriksaan hybridisasi yang mana hanya suatu molekul DNA dengan urutan dikenali yang akan dipasangkan dengan urutan DNA yang telah ditandai (diblot). Pemeriksaan DNA berlabel dengan fluorescents atau chromogenic berpijar sehingga dapat teridentifikasi. Dengan pengujian pola dari hybridisasi dengan sinar X atau Autoradiografi, peneliti dapat menentukan fragmen yang berisi DNA sequence spesifik atau gen.

Southern blots digunakan penemuan gen dan pemetaan, evolusi dan studi pengembangan, forensik dan diagnostik. Dalam tingkat genetik untuk memodifikasi pada organisme, Southern blot digunakan sebagai test untuk memastikan bahwa bagian DNA tertentu mengenal urutan gen. Southern blot analysis untuk menandai karakter transforman. Southern blot analysis bermanfaat untuk mengidentifikasi bentuk berbeda, menentukan memasukkan atau menyisipkan jumlah copy dan untuk mendeteksi gross DNA penyusunan kembali yang mungkin telah terjadi perubahan. Jika kamu sedang menganalisis ß - galactosidase dengan memasukkan atau menyisipkan dan dipotong - potong dengan EcoRV maka akan dihasilakn potongan sekitar 1kb dari atas dan bawah dari urutan ß - galactosidase persandian dimulai. Pemecahan oleh enzim restriksi, Analisis Gel, dan bloting.

Ini adalah prosedur standar dari Southern blot analysis.
1. dipecah sedikitnya 1 ug gen Drosophila dengan enzim restriksi yang sesuai. Dipecah 1 - 5 ug DNA dalam volume 20 ul dengan 10 unit enzim. Pemecahan dilalukan selama 4 - 12 jam.
2. Periksa kualitas pemecahan dengan analisis 100 ng dari tiap sample dalam minigel. meliputi sample control yang belum dipecah sebagai perbandingan. Sample yang telah dipecah tampak sebagai band - band dari repetitif sequen (urutan berulang) yang dapat diperlihatkan.
3. Sisa DNA 1% pada gel agarose meliputi jalur dengan penanda lamda untuk gel yang diwarnai dengan ethidium bromida dan difoto.
4. Gel diwarnai selama 20 menit dalam 1ug/ml ethidium bromida. Destain dalam air selama 10 menit dan difoto.
5. Serap gel selama 15 menit dalam 0.12 M HCL - bromophenol blue hingga menguning.
6. Serap gel dalam 0.4 M NaOH selama 30 menit.
7. Potong 3 potongan dalam memblot kertas yang akan meluas sekitar 1 inci di luar gel pada empat sisi. Rendam masing-masing dengan 0.4 M NaOH Dan tumpukan dalam suatu kaca.
8. Potong gel sampai pertengahan dan membuang bagian puncaknya. Dengan memotong jalur pertengahan, identasi akan tertinggal di puncak gel dimana gel diratakan dengan prosedur blotting, dan ini dapat digunakan untuk penyaringan baik telah ditempatkan dia tas gel. Hempaskan gel yang tak teratur dan menempatkannya pada pertengahan tumpukan kertas hisap untuk mendorong ke luar gelembung udara.
9. Gel dilemparkan disebabkan DNA pada umumnya semakin dekat kepada sisi bawah gel. frame gel dengan potongan plastik. Plastik meluas di bawah tepi gel dari 1 - 2 milimeter. dengan perlahan memaksa gelembung udara memberes bebas dari gel. Plastik mencegah penyangga mengalir di sekitar gel.
10. Suatu potongan Genescreen yang lebih untuk memenuhi ukuran gel. Permukaan basah gel dengan beberapa tetesan 0.4 M NaOH. perlahan - lahan meletakkan gen menyaring ke permukaan gel. Hindari menjerat gelembung udara di bawah saringan juga menghindari bergesernya saringan yang berhubungan dengan gel seperti beberapa DNA mungkin telah mulai untuk dipindahkan ke saringan.
11. Dua potongan kertas hisap untuk memenuhi Genescreen dan meletakkan hingga lembar tersebut mengeringkan pada waktu yang sama di atas saringan. Kertas pertama basah, dan melicinkannya sebelum menambahkan yang kedua. Potongan yang kedua basah sepenuhnya mengumpulkan tumpukan paper towels.
12. Menumpuk 1 inchi lapisan dari paper towels di atas potongan puncak kertas hisap. Towels harus memotong untuk memenuhi ukuran saringan.
13. Tempatkan potongan flat/plexiglass atau kaca yang diletakkan di paling atas. Menimbang tumpukan yang hancur bersama suatu botol yang berisi 200 - 500 ml tentang segala bentuk. Kemudian DNA dipindahkan selama 6 jam.
14. Setelah transfer, dipindahkan ke saringan dandiserap selama 15 menit dalam 200 ml 0.2 M Tris-Cl pH 7.5, 2X SSC.
15. Blot filter dikeringkan dengan paper towels dan kemudian dibiarkan kering selama sedikitnya 1 jam. Saringan dapat disimpan bila telah kering, keadaan ini cukup untuk menentukan DNA ke dalam saringan. Tidak kebutuhan untuk membakar saringan genescreen untuk menyertakan DNA.

Persiapan DNA radiolabeled untuk menyelidiki Southern blot. Beberapa kotak persediaan berbeda untuk pemeriksaan radiolabeling. Kotak berdasarkan pada cat dasar acak menghasilkan radioaktif memeriksa dengan aktivirtas kira-kira 109 cpm/ul. Suatu fragmen DNA gel-purified akan disediakan untuk reaksi dasar yang acak. Sejak reaksi dasar paling acak terutama yang sama, prosedur yang berikut dapat digunakan untuk memindahkan "unincorporated radioactive nucleotide"
1. Stop reaksi dengan menambahkan 0.5 M EDTA dengan konsentrasi akhir kira-kira 20 mM.
2. Tambahkan Nambahkan 400 ul TE, 1 ul 5 mg/ml DNA salmon dan 20 ul 100 mM spermine. Campuran dengan baik.
3. Inkubasi di atas es selama 15 menit, sentrifugasi mesin selama 15 menit dan buangan supernatant.
4. Pecahkan butir pada 37o C dalam 50 ul 0.5 M NaCl/TE selama 10 menit untuk memecahkan.
5. Tambahkan 200 ul TE dan menghitung jumlah kecil untuk menentukan efisiensi label DNA. Simpan pemeriksaan di dalam lemari es.

Analisis Southern blot dengan pemeriksaan radiolabeled. Saringan pertama direndam untuk periode yang singkat dalam pemeriksaan campuran hybridisasi. Kemudian pemeriksaan ditambahkan secara langsung hybridisasi solusi. Tidak ada prehybridisasi campuran khusus.
1. Gulung blot ke dalam silinder sehingga sisi DNA sisi ke arah pusat silinder dan menempatkan blot dalam tabung 50 ml.
2. Siapkan kira-kira 10 ml hybridisasi campuran (minus probe) dalam 200 ul 5 mg/ml DNA salem sonicated selama 5 menit dan vampurkan secara menyeluruh 10 ml 6X SSC, 50% Formamide, 1% SDS, 10% Dextran Sulfate. (30 ml solusi yang kekurangan DNA salmon dapat dibuat dengan meletakkan 9 ml 20X SSC, 15 ml Formamide, 3 ml 10% SDS, 3 g Sodium Dextran Sulfate ke dalam suatu tabung 50 ml dan putar campuran itu dalam tungku hybridisasi tungku pada suhu 42o C selama beberapa jam. Simpan campuran pada 20o C dan suhu panas 42o C sebelum penggunaan)
3. tambahakan campuran hybridisasi ke dalam tabung yang berisi blot, cap tabung, dan berputar tabung dalam tungku hybridisasi pada suhu 42o C selama minimal 15 menit.
4. Didihkan 5 - 10 juta cpm’s dalam volume 200 ul TE selama 5 menit dan kemudian menempatkan pemeriksaan di atas es.
5. Mindahkan tabung yang berisi blot dari tungku hybridisasi dan menambahkan pemeriksaan dengan hybridisasi solusi. Mengikhtisarkan tabung, campurkan dan kembali tabung ke tungku hybridisasi. Putar tabung dengan suhu 42oC.
6. Hari berikut, menuangkanhybridisasi radioaktif dan mencampurkan ke dalam tabung untuk dipergunakan kembali jika diperlukan. Menyimpan campuran hybridisasi dalam lemari es. (untuk digunakan pemeriksaan kembali, didihkan campuran selama 15 menit)
7. Siapkan total 200 ml 2X SSC, 0.5% SDS untuk mencuci blot. Tambahkan kira-kira 30 ml dari solusi ini ke dalam tabung yang berisi blot itu, rekap dan berputar tabung pada suhu 25o C selama 15 menit. Buang dengan mencuci limbah radioaktif dan mengulangi memeriksa prosedur dua kali.
8. Pindahkan blot dari tabung 50 ml dan cuci blot selama 15 menit pada suhu-kamar dalam baki dengan 2X SSC, 0.5% SDS (~ 100 ml). buang tabung radioaktif.
9. Siapkan 200 ml 0.1X SSC, 0.1% SDS dan dalam keadaan hangat atau pada suhu 55o C.
10. Gulungkan tblot ke dalam suatu silinder dengan sisi DNA ke arah pusat dan menaruhnya ke dalam tabung baru 50 ml. Tambahkan 30 ml 0.1X SSC, 0.1% SDS pada blot dan putar tabung dalam tungku hybridisasi selama 15 menit pada suhu 55o C. Buang dengan mencuci dan mengulangi memeriksa prosedur sampai solusi habis tercuci.
11. Pindahkan blot dari tabung dan tempatkan pada flat potongan plastik. Blot cairan kelebihan dibuang tetapi tidak dengan saringan untuk dikeringkan sepenuhnya.
12. Singkapkan saringan ke film sinar x Penyinaran memfilmkan dalam intensif screen.

Ini adalah suatu ringkas dari Southern blot dilakukan dan seperti apa data yang dapat diperoleh. Southern blots memberikan penyelidikan atau analisis untuk menentukan bobot molekular suatu restriksi fragmen-fragmen dan untuk mengukur sejumlah relatif dalam contoh berbeda.
1. DNA (genomic atau sumber lain) dipecah dengan enzim restriksi Enzim restriksi endonuclease digunakan untuk memotong high-molecular-weight DNA strands ke dalam fragmen yang lebih kecil. DNA fragmen kemudian adalah di electroforisis pada suatu agarose gel untuk dipisahkan berdasarkan ukurannya pada umumnya nampak sebagai band. DNA terdenaturasi menjadi rantai tunggal denganinkubasi dengan NaOH.
2. Jika sebagian dari fragmen DNA lebih besar dari 15 kb, kemudian sebelum di blot, gel mungkin diperlakukan dengan suatu asam, seperti HCL encer, yang depurinates fragmen DNA, memotong DNA ke dalam potongan lebih kecil, dengan begitu membiarkan perpindahan yang lebih efisien dari gel ke membran. DNA ditransfer ke membran seperti lembaran dari kertas hisap khusus. DNA fragementsw mempertahankan pola separasi yang sama dalam gel. Blot di inkubasi dengan banyak copy dalam pemeriksaan yang merupakan DNA single-stranded.
3. Jika metoda perpindahan alkali digunakan, gel yang mengandung DNA ditempatkan ke dalam suatu solusi bersifat alkali (Secara khas berisi Sodium hydroxide) untuk mengubah sifat DNA yang double-stranded. Denaturation dalam lingkungan bersifat alkali menyediakan untuk ikatan DNA yang bermuatan negatif ke dalam membran bermuatan positif, memisahkannya ke dalam rantai DNA tunggal untuk pemeriksaan hybridisasi dan menghancurkan RNA residu yang masih hadir dalam DNA.
4. Pemeriksaan ini akan membentuk base pairs dengan DNA sequence yan komplit dan band dalam bentuk molekul DNA double-stranded. Pemeriksaan tidak bisa dilihat tetapi selain dengan radioaktif atau enzim dapat di lihat (phosphatase bersifat alkali atau horseradish peroxidase).
5. Penempatan lokasi pemeriksaan diungkapkan dengan inkubasi substrate tanpa terwarnai itu mengikat enzim mengkonversi produk diwarnai yang dapat dilihat atau menyemburkan cahaya yang akan disingkap dengan sunar X. Jika pemeriksaan telah diberi label dengan radioaktifitas, dapat menyingkapkan film sinar X secara langsung.
Misalnya pada Southern Blot analysis of DNA Panel yang kiri adalah suatu gel electrophoretic yang diwarnai dengan ethidium bromida. Total DNA telah diekstrak dari 9 clon plasmid (lanes ## 1-9), yang didigesti dengan pembatasan endonuclease restriksi tertentu dan yang dipisahkan menurut ukuran oleh electrophoresis. DNA yang terlihat dinodai nampak dengan tidak ada ikatan terpisah, tidak satupun urutan DNA hadir lebih dari satu copy. Molekular dengan berat standar Standard mempunyai satu rangkaian fragmen DNA dari ukuran dikenal. Suatu clon fragemen DNA telah terisi muatan lane # 10: beban standar menandai adanya ukuran sekitar 400bp.

Panel tenggah adalah suatu southern blot autoradiogram gel yang sama. DNA dalam gel telah ditransfer (yang dinodai) ke suatu filter, kemudian filter diunjukkan ke suatu DNA radioactively-labelled yang dibuat dari DNA memuat jalur # 10. Saringan kemudian adalah diunjukkan dengan fil sinar X. Di mana pemeriksaan DNA ditemukan suatu urutan homolog sepancaran yang di nodai, base-pairs (hybridizes) untuk DNA. Radioaktifitas kemudian menyingkapkan film itu dan menghasilkan suatu band gelap di atas film sinar X.
Panel kanan adalah suatu bagan untuk southern autoradiogram, isi informasi adalah kehadiran atau ketidakhadiran suatu band serta ukurannya. Kehadiran suatu band menunjukkan bahwa urutan DNA homolog dalam pemeriksaan itu DNA hadir dalam clone ## 3, 4,& 8, dengan ukuran yang sama ketika pemeriksaan, dan ketidakhadiran clone ## 1 , 2, 5,& 9. Di jalur # 6 urutan homolog yang hadir tetapi dengan suatu lokasi pembatasan tambahan yang memotong fragmen itu menjadi dua fragmen lebih kecil. Analisa ini menunjukkan bahwa gen menarik menjadi clon sukses dengan satuan tertentu dalam plasmid, dan ada variasi genetik dalam clone #6. Gen ini sekarang dapat dianalisa lebih lanjut.

A. Pria normal : ikatan tunggal yang ukurannya normal serta tidak mengandung metil
B. Wanita normal : dua ikatan yang ukurannya normal, satu tidak mengandung metil (kromosom X aktif) dan satu mengandung metil (kromosom X yang tidak aktif)
C. Pria premutasi : ikatan tunggal yang ukurannya ditingkatkan serta tidak mengandung metil. Premutation ini mempunyai 75 pengulangan (diukuran oleh analisis PCR).



D. Wanita premutation : empat ikatan dengan pola tidak mengandung metil (X aktif)) dan mengandung metil (X tidak aktif) bentuk kedua-duanya premutasi dan ikatan normal. Premutation ini mempunyai 92 pengulangan (diukuran oleh analisis PCR)
E. Pria mutasi penuh : ikatan > 200 pengulangan yang ikatannya mengandung metil. Ketidakhadiran suatu ikatan tidak mengandung metil normal. Dalam hal ini ada tiga ukuran mutasi penuh berbeda, 280, 430 dan 920 pengulangan (diukur dengan Southern blot analysis)
F. Wanita, mutasi penuh : ikatan > 200 pengulangan yang ikatannya mengandung metil. Dua ikatan normal dari allel yang normal adalah juga tersedia. Mutasi penuh ini mempunyai 355 pengulangan (diukur dengan Southern blot analysis)
G. Pria mosaik : Mutasi penuh dan premutation. Dalam hal ini mutasi yang penuh mempunyai 510 pengulangan (diukur dengan Southern blot analysis) dan premutation mempunyai 84 pengulangan (diukur dengan analisis PCR)